4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是一种重要的氢离子缓冲剂，其在pH为6.8～8.2的范围内具有良好的缓冲能力，能较长时间控制恒定的pH。使用浓度为10～50mmol/L，一般培养液内含20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸即可具有良好的缓冲能力，且对细胞无毒性作用。

(1)hepes缓冲液可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中,再过滤除菌.每1000ml培养液中加入2.38克HEPES,待溶后用lN NaOH 调pH至7.2,滤过除菌后使用.此时HEPES的使用浓度为10 mmol/L.

(2)亦可配成 100 x 贮存液（l mol/L），使用前取 99ml培养液加入 lml贮存液，最终应用浓度仍为10mmol/L。l mol/L（100 x）hepes缓冲液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml双蒸水中,用lN NaOH调pH至7.5一8.0,然后用水定容至100ml,过滤除菌,分装小瓶（2ml/瓶）,4℃或-20℃保存.

HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）是一种非离子两性缓冲液，具有高度极性，对多种化学试剂和酶呈惰性，不参加和不干扰生物化学反应的过程，对酶化学反应等无抑制作用，因此可专门用于对细胞器和极易变性的、pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。直接使用1,2-二氯乙烷作为溶剂，在装有机械搅拌、温度计的100mL的三口瓶中加入羟乙基哌嗪（5.00g,0.02mol)，碳酸钾K2CO3（6.00g，0.04mol），50mL1,2-二氯乙烷，油浴加热90℃（1,2-二氯乙烷沸点85℃），搅拌反应20h。停反应，过滤，用200mL乙酸乙酯（EA）洗涤滤出的盐。滤液旋干，得2.6gHEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）固体。用作生化试剂生物缓冲剂；分离与分析RNA核组分的反应缓冲液、预杂交缓冲液、杂交缓冲液；用于RNA与T4RNA分子生物学级用于用T4 RNA连接酶进行RNA3' -末端标记，分离与分析核RNA之反应缓冲液组分、预杂交缓冲液缓和杂交缓冲液成分细胞-细胞黏附，细胞短期聚集培养，清洗组织、细胞所用缓冲液