放线菌素V作用与更生霉素相近，有较广的抗瘤谱，此外还具有较强的抗细菌、真菌和病毒的作用。

有研究发现放线菌素V能迅速通过渗透作用穿过大多数细胞膜，并选择性聚集在细胞核内，在细胞生物学的研究中，人们发现放线菌素可以抑制转录过程。放线菌素V主要作用于RNA，抑制RNA的合成，高浓度时则同时影响RNA与DNA 合成。作用机理为嵌合于DNA双链内与其鸟嘌呤基团结合，抑制DNA依赖的RNA 聚合酶活力，干扰细胞的转录过程，从而抑制mRNA合成。为细胞周期非特异性药物，以G1期尤为敏感，阻碍G1期细胞进入S期，抑RNA合成。