细胞融合技术：原理、方法与应用！

1、细胞融合的概念

细胞融合（cell fusion）是一种生物技术手段，通过自然或人工诱导的方式，使两个或多个细胞结合在一起，形成一个新的单细胞结构。这一过程涉及细胞膜的相互连接与融合，细胞质的混合，以及细胞核、细胞器和酶等细胞组分的整合，最终形成一个具有混合遗传特性的新细胞体系。

细胞融合可以根据融合细胞的来源分为同种细胞融合和异种细胞融合。异种细胞融合又称为体细胞杂交（somatic hybridization），是指在体外通过人工方法将不同物种或不同类型的细胞进行融合，形成一个新的杂合细胞的过程。
细胞融合技术能够将两个亲本细胞的遗传信息重新组合，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上的定位、改良动物遗传特性以及创造符合人类需求的新细胞系的重要工具。

2、细胞融合机理

细胞融合的核心过程主要包括：脂质双分子层的相互接触与靠近，细胞桥的形成，以及细胞质的混合与细胞核的融合。

3、细胞融合的方法

细胞融合可通过生物法、化学法和物理法实现。

• 生物法：主要通过病毒诱导（如仙台病毒）来实现。病毒作为媒介，促使细胞聚集，并在病毒酶的作用下诱导细胞融合。
• 化学法：常用聚乙二醇（PEG）结合高pH和高钙离子环境来诱导细胞融合。这种方法操作简便，已成为目前细胞融合的主要技术手段。
• 物理法：包括显微操作和电融合法等。显微操作需要高精度的设备，而电融合法则因其可控性强、效率高且无毒性，受到广泛应用。

1）自发融合

自发细胞融合是指在没有人为干预或外加诱导因素的情况下自然发生的细胞融合现象。例如，生物体自然受精过程中的精子与卵子结合就是一个典型的自发细胞融合实例。

2）诱发细胞融合

（1）病毒促进细胞融合

多种病毒具有诱导细胞融合的能力，包括一些具有致癌或致病性的病毒，如疱疹病毒、天花病毒、副流感病毒和副黏液病毒等。然而，由于这些病毒的毒性较大，它们在实际应用中受到限制。

最常用的病毒是灭活的仙台病毒（HVJ），它是一种RNA病毒。仙台病毒（HVJ）是一种包膜病毒，其诱导细胞融合的活性并非来自病毒内部的RNA，而是由其外膜所介导。

a、病毒诱导细胞融合的过程

首先，细胞表面会吸附大量的病毒颗粒。随后，细胞之间发生聚集。在几分钟到几十分钟内，病毒颗粒从细胞表面脱落，而此时相邻细胞的细胞膜开始融合，细胞质相互混合，最终形成融合细胞。

b、HVJ促融机制

当病毒位于两个细胞之间时，病毒表面的刺突（spike）上的神经氨酸酶会降解细胞膜上的糖蛋白，导致细胞膜在病毒周围局部聚集。在高pH和高浓度钙离子（Ca²⁺）的条件下，这些局部聚集的细胞膜会发生融合。

（2）化学融合剂促进细胞融合

化学融合剂的种类丰富，包括高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质以及多肽等。在这些化学融合剂中，聚乙二醇（PEG）是最为常用的一种。

a、盐类融合法

这种方法是最早应用于诱导原生质体融合的技术之一。盐类融合剂对原生质体的损伤较小。

b、高钙和高pH值融合法

高浓度的Ca²⁺和较高的pH值能够诱导细胞融合。原生质体融合受到多种因素的影响，尤其是环境中的阳离子。融合过程中的pH值对原生质体融合也有显著影响。通常情况下，钙离子和镁离子有助于促进融合。当存在钙离子时，融合效率较高。然而，即使在缺乏钙离子的情况下，如果pH值较低，融合频率也会增加。

c、聚乙二醇融合法

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种由多个重复单元组成的高分子化合物。其分子结构中通过醚键连接，使得分子末端带有弱负电荷。这种特性使得PEG能够有效促进细胞膜之间的相互作用，从而诱导细胞融合。

聚乙二醇（PEG）的物理性质和应用特性如下：

• 物理性质：PEG是一种高分子化合物。当分子量在200 - 700时，PEG呈现为无色、无臭的黏稠液体；而当分子量超过1000时，它则表现为乳白色蜡状固体。PEG具有良好的溶解性，可以溶于水、乙醇以及其他多种有机溶剂。此外，PEG对热稳定，且与许多化学试剂不发生反应。
• 细胞融合应用：作为细胞融合剂，通常选用分子量为4000的PEG。常用的浓度为50%，pH值在8.0 - 8.2之间（可通过10%的NaHCO₃溶液进行调整）。此外，也有研究采用30% - 50%的PEG浓度，并添加10%的二甲亚砜来增强融合效果。
• 分子量与融合效果：分子量较低的PEG融合效果较差，且具有一定的毒性；而分子量过高的PEG则过于黏稠，操作不便。实验表明，在50%浓度且pH偏碱性（pH 8.0 - 8.2）的条件下，PEG的融合效果最佳。
• PEG的选择与质量控制：不同批次的PEG即使分子量相同，其融合率也可能存在显著差异。因此，在选用时必须注意批次差异，并对每一批次的PEG进行细胞毒性试验，以确保其安全性。为了获得更好的融合效果，建议选择高纯度的PEG，例如用于气相色谱的PEG。

Ⅰ、原理

聚乙二醇（PEG）能够通过氢键与水分子结合，这种结合会导致细胞脱水，进而引起细胞质膜结构的改变，最终促进细胞融合的发生。

为了有效利用聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，通常需要采用较高浓度（40% - 50%，分子量为4000）的PEG溶液。然而，高浓度的PEG可能导致细胞因过度脱水而受到显著损伤。因此，选择合适的PEG分子量、浓度以及作用时间是确保细胞融合成功的关键因素。

PEG在细胞融合中至少具有以下两方面的作用：

1. 促进细胞聚集：PEG能够使细胞相互靠近并聚集在一起。
2. 诱导细胞膜融合：PEG可以破坏细胞膜接触部位的磷脂双分子层结构，促使相邻细胞膜之间发生融合，从而使细胞质相互连通，最终形成一个大型的双核或多核融合细胞。

Ⅱ、机理

PEG分子带有大量负电荷，这些负电荷与细胞膜表面的负电荷在Ca²⁺的桥接作用下形成静电键，从而促进不同来源的细胞膜之间的黏附和结合。

在高pH和高Ca²⁺溶液的作用下，Ca²⁺与质膜结合的PEG分子被洗脱，导致电荷平衡被打破并重新分布。这种电荷重新分配使得两种细胞膜上的正负电荷相互连接，从而形成具有共同质膜的融合细胞。

Ⅲ、PEG诱导融合的优点

融合成本低无需特殊设备；融合子产生异核率特别高；融合过程不受物种限制。

Ⅳ、缺点

PEG存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合过程繁琐等缺陷

Ⅴ、注意事项

PEG融合的关键因素

• 作用时间：PEG融合的关键在于处理时间。处理时间越长，融合率越高，但同时对细胞的毒性也越大。因此，通常将处理时间控制在1.0 - 1.5分钟以内。如果融合后不继续培养细胞，处理时间可以延长至20分钟。
• PEG分子量和纯度：PEG的分子量和纯度对融合效率有显著影响。分子量和浓度越高，融合率越高，但细胞毒性也越大。为了平衡融合效率和细胞毒性，常用的PEG相对分子质量为1000 - 4000，浓度为40% - 60%。
• 细胞密度：融合效果与细胞密度密切相关。适当的细胞密度可以提高融合率，但过高或过低的细胞密度都可能影响融合效果。
• 融合液成分：在融合液中加入少量CaCl₂，不仅可以维持一定的电导率，还能对细胞起到保护作用。
• 温度：生物膜的流动性与温度成正比。在细胞可承受的温度范围内适当提高温度，可以提高融合率。

（3）物理诱导融合

a、电融合技术

细胞电融合是以脂质膜和脂质-蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段。

在短时间强电场作用下，细胞膜会发生可逆性电击穿（Reversible Breakdown）。此时，细胞膜瞬间失去其高电阻和低通透性的特性，但在数分钟后会恢复正常。当这种可逆性电击穿发生在两个相邻细胞的接触区域时，可以诱导它们的细胞膜相互融合，进而导致细胞融合。

Ⅰ、融合原理

电融合是基于细胞在电场中的极化现象。当细胞置于电场中时，细胞会极化成偶极子，并沿着电力线排列成串状结构。随后，通过施加高强度、短时程的电脉冲，细胞膜会发生瞬间的击穿，这种击穿是可逆的。在细胞膜的高电导状态期间，相邻细胞的膜结构可以相互融合，从而实现细胞融合。

首先，利用双向电泳技术使细胞间的接触变得极为紧密。与普通电泳使用直流电推动分子移动不同，双向电泳采用高频交流电。这种交流电会在细胞等微粒内部诱导去极化，促使细胞聚集并排列成串珠状，彼此紧密接触。

随后，施加短暂的高压脉冲，使细胞膜发生穿透。接着，细胞膜相互结合，从而实现细胞融合。为了稳定这一过程，在短时间内需要持续施加交流电压。

刚完成电融合的细胞可以被称为异核体。这是因为尽管细胞膜已经在表面发生了融合，但在细胞内部仍然可以观察到两个或多个细胞核。随后，这些细胞核会在细胞内部逐渐发生融合。在大多数情况下，这一过程会导致细胞核中染色体数量的显著减少。

Ⅱ、电融合的优点

• 无细胞毒性：电融合过程中不存在对细胞的毒害作用，不会引入化学试剂或病毒等有害物质。
• 融合效率高：电融合能够高效地诱导细胞膜融合，形成异核体。
• 操作简便：电融合技术的操作过程相对简单，易于掌握和应用。

Ⅲ、注意事项

• 介质要求严格：通常需要使用高纯度蒸馏水，并选择合适的非电介质溶液（如甘露醇等）来配制等渗性介质。
• 电压和时间控制：需要注意精确控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度及作用时间，以避免细胞过度聚集或发生可逆性降解。

b、激光诱导法

激光诱导细胞融合技术通过激光微束对相邻细胞接触区域的细胞膜进行精准破坏或扰动，能够在显微镜下实现两个特性不同、大小各异的细胞的融合。

即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。

随着质膜上微孔的可逆性变化，细胞逐渐发生变形并开始融合，最终合并为一个完整的细胞。在使用该技术时，可以采用以下方法使细胞接触：光俘虏法：利用光镊技术将细胞固定并靠近，使其相互接触。低浓度PEG聚集法：使用低浓度的聚乙二醇（PEG，浓度为5%）促使细胞聚集并相互接触。

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